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第23卷第4期2005年7月泉州师范学院学报(自然科学)JournalofQuanzhouNormalUniversity(! R, ]+ f. |3 U* a
Natural, H! \8 a! t( ~2 j5 }2 j
Science)Vol.
& X% |9 m: Q) V0 r7 G+ {23 No.4Jul.: N0 @3 _ \! q* X, [
2005: t% R7 [+ z; C) `) ~; [
. ?2 E1 v. A' e. x9 E张巧利1,孙亮先1,郭冬生1,胥保华2
8 q# B! p8 i6 l* ]& P(1.泉州师范学院模式生物研究中心,福建泉州 362000;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安 271018); F6 Q4 R7 F' M5 V4 h9 J
摘 要:简述了建立蜜蜂转基因技术体系的方法和筛选标记.以显微注射法将改造过的pig27 X1 @% `( E6 O( i
gyBac、mariner等转座子转基因载体导入受精卵是蜜蜂转基因工作的最佳候选方案,精子介导法* h$ S6 A0 N K! Y. n
和病毒载体法也值得尝试.增强型荧光蛋白(EGFP)基因是转基因蜜蜂的最佳筛选标记.并对蜜蜂转基因技术体系在基因功能研究和生物反应器的开发等方面的应用前景进行了探讨.①( _& g- `; @: u e1 Y$ y6 a( n
  关键词:蜜蜂;转基因;载体;显微注射;转座子;精子  中图分类号:Q782  . B. S s( ?9 P$ H
文献标识码:A  文章编号:1009-8224(2005)04-0094-06  ^' I$ k" a. E. ~9 t2 A3 z( C- h
5 [, R3 B' R7 b 蜜蜂是最重要的对农业有益的社会性昆虫,具有世代周期短(约28d)、繁殖力强(每只蜂王日产卵可达1500-2000粒)、行为复杂、孤雌产雄、可人工饲养等特点,已被作为一种新型的模式动物,用于研究免疫、过敏性反应、抗生素抗性、发育、精神健康、寿命和X染色体疾病等人类健康方面的问题.蜜蜂全基因组测序工作已经完成,2005年5月,基因组的拼接序列(version3.0)已经释放(http://www.hgsc.bcm.tmc.edu).蜜蜂的EST计划也已经开展,并被制备成cDNA芯片[1].这些成果表明蜜蜂研究已经进入后基因组研究时代.而作为基因功能研究的基本技术手段的转基因技术在蜜蜂上目前尚未成功建立.1982年,Rubin等开创性的以果蝇中的P-转座子作为载体将外源基因成功地转化进生殖系(germline)染色体,获得第一只转基因果蝇[2],经过20多年的研究,家蝇、蚊子、家蚕等多种昆虫的转基因体系先后被建立.本文综述了其他昆虫转基因工作中可供建立蜜蜂转基因技术借鉴的技术,并展望了该技术的应用前景.3 c3 r" P/ I; p, }! N, a; U3 A4 I
1 可用于蜜蜂转基因的技术
4 f: E+ r K/ b( s, o' W& f1.1 显微注射技术6 Q3 b9 D& ?; c: C' U
显微注射是借助光学显微镜,直接把外源性DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、细胞或卵母细胞中,然后生产转基因动物个体.1980年,Gordon等人首次用显微注射的方法将纯化后的DNA注射进小鼠的晶胚,获得了转基因小鼠[3].在此后的一年时间内,共有六个实验室陆续报道通过向原核期的小鼠胚胎显微注射DNA,获得了转基因小鼠[4].从此,向原核期的胚胎直接注射纯化的DNA作为生产转基因动物的方法被确立下来,到目前为止仍是一种比较可靠和经常使用的方法.
3 K9 c, f% U# k: Q2 j/ a; E9 R 蜜蜂的卵适于进行显微注射操作.蜂卵的受精是在蜂王向工蜂房或王台中产卵时发生的.产卵时,贮精囊受到巢房口挤压,精子通过卵孔进入卵,在2h内精核与卵核发生融合,完成受精过程.据观察,蜂卵产下后在1—2h内卵孔是开启的,利用这一特性,可在卵产下2h内通过卵孔进行显微注射,从而避免损伤卵,又能在受精卵发生第一次卵裂前将携带外源DNA的载体导入到卵内的合适位置,便于转基因操作.但是,蜜蜂是一种高级社会性昆虫,幼虫需要工蜂来喂养.如果卵或者幼虫稍呈异常,就会被工蜂抛弃,给转基因幼虫的饲养带来不便.根据这一特性,可将已显微注射过的卵置于35℃、80%的相对湿度下培养65h后再转入蜂巢孵化,并且尽量不对卵进行化学药品处理.# U% i. g: \) ?5 `5 w. F
1.2 精子介导法
$ X. |3 X0 r/ n# HBrackett等(1971年)发现精子细胞具有自发地吸收外源DNA,并可在受精的过程中将外源DNA携带进卵内[5].所以,可以用精子作为转移外源DNA的载体,通过体外授精,将外源DNA带入受精卵进而发育成个体,从而生产转基因动物.这一方法极为方便,避免了对卵原核的操作,符合生理受精过程,效率较高.1989年Lavitrano等利用这一设想第一次成功地制备出转基因小鼠[6].他们用成熟的小鼠精子与pSV2CAT质粒DNA共同孵育15min以上,二者结合后,在体外与小鼠卵授精,受精卵发育至2细胞阶段,移至假孕小鼠子宫中,待其生出小鼠后,用Southernblot法检测了250只子代小鼠,其中30%携带并表达外源基因.该实验的成功开辟了转基因动物生产的新途径.1993年,Nakanishi等利用精子转染法建立转基因鸡[7],Cappello等利用该方法建立了表达人DAF基因的转基因猪[8],Rottmann等(1992)对上述精子载体法进行了改进,他们将外源DNA在与精子共同孵育之前用脂质体包埋,脂质体与DNA相互作用形成脂质体2DNA复合体.这种复合体比较容易和精子细胞膜融合,从而进入细胞内部,改进以后的精子载体法在转基因鸡的制作上获得了满意的结果[9].对12日龄鸡胚用Southern印迹杂交法检测发现转基因阳性率为26%,最理想的一次阳性率高达92%.实验还显示外源DNA并未整合进宿主基因组,而是以附加体的形式存在于染色体之外.Per2ry等(1999)先将精子与外源基因共孵育1min,然后将精子的头部显微注入MⅡ期的小鼠卵母细胞,在出生的后代小鼠中转基因阳性率可达20%以上,而且精子膜破损更有益于转基因动物的获得[10].蜜蜂上,Atkinson(1991)首次将蜜蜂精子与外源DNA进行了共培养[11],Robinson等(2000)曾以精子为外源DNA载体,通过人工授精将携带外源DAN的蜜蜂精子导入蜂王贮精囊,并且在蜂王所产的后代中可以检测到外源DNA,但发现外源基因未能整合进基因组[12].以精子作载体法的最大优点是方法相对简单易行,不需昂贵的显微操作设施及复杂的操作技巧.
1 M4 J* v- m# q d/ |: m1.3 其他载体介导法 ; q3 u; y& y. \& u$ z2 l
在昆虫转基因研究历程上,曾经尝试过直接注射DNA、基因枪法、精子DNA载体法、母体注射法、电击法等多种方法,但效果均亚于转座子载体法和病毒载体法[13].Nagaraju等(1996)将线状DNA直接注射到家蚕卵内,结果几小时内外源DNA就被降解或环化,不能整合进基因组中[14];Tamura等(1990)将含有家蚕基因启动子的pBR322质粒导入蚕卵,发现质粒中的CAT基因仅能瞬时表达[15].澳大利亚国立大学分子与群体遗传学研究组的JohnGib2son与日本动物工业国家实验室的KiyoshiKimura曾在1997年进行合作,先后试图以P转 座子及来自果蝇的Mariner转座子Mos1(mosaic21)为载体进行蜜蜂转化,但均未获得成功.其原因可能是由于他们所采用的转座子载体并不适合蜜蜂,即所用的载体系统与寄主系统不相容,而导致启动子无法驱动协助载体基因(helpergenes)及报告基因的表达.目前,Kimura实验室及美国的一个实验室正在尝试以来自鳞翅目昆虫Trichoplusiani的piggyBac转座子进行蜜蜂的转化工作(Robertson).寻找可在目的昆虫基因组中移动的转座子或病毒成为建# s( H' A3 M$ L0 a' B! L
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发表于 2016-5-11 17:35:23
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发表于 2016-5-11 18:49:12
