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丹参、甘草是临床上常用的中药，可以用于治疗炎性疾病 ［ 1-2］。丹参与甘草对痤疮具有一定治疗作用，二者可以产生协同作用 ［ 3-5］。但所含的主要药效成分丹参酮II A （tanshinone Ⅱ A ，TSN Ⅱ A ）、丹参酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）和甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）口服生物利用度均较低，难以到达病变部位发挥药效。其中，TSN Ⅱ A 和GA的水溶性较差，溶解度仅分别为0.24 mg·L-1［6］和6.32 mg·L-1［7］，严重影响口服吸收；Sal B渗透性低、稳定性差 ［ 8］。因此，选择一个适当的传递系统以提高上述药物对痤疮的药效尤为重要。

微乳凝胶作为一种新型透皮给药载体，是指将制备的微乳加入至适宜高分子材料凝胶基质中混匀，形成的半固体凝胶大分子网状结构 ［ 9］。微乳凝胶的产生克服了微乳流动性强、保留时间短、黏附性差等缺点，是一种同时具备微乳和凝胶双重特点的制剂。一方面能够改善药物稳定性，提高难溶性药物的溶解度，另一方面易于涂布且对皮肤黏膜无刺激性 ［ 10］。当乳剂凝胶与皮肤接触时，药物不仅可以缓慢经皮吸收到体内发挥药效，同时还对皮肤表面的病症起到很好的直接治疗作用。微乳凝胶体系还可减少药物在肝脏的首过效应 ［ 11］，是适用于易挥发、易被氧化、水难溶性药物的新型透皮给药载体。

皮肤角质层屏障作为微乳凝胶给药的天然屏障，是影响其有效成分吸收的主要障碍。滚轮微针作为物理促透方法之一 ［ 12］，具有操作便利、无痛等特点，其促透机理为滚动时短暂破坏角质层，形成多个微小孔道，药物通过微小孔道渗入真皮层，产生疗效。将微针给药技术与纳米给药（脂质体、纳米粒）体系相结合 ［ 13-14］，可以促进该给药系统药物的吸收。因此，本研究针对TSN Ⅱ A 、Sal B、GA生物利用度低等缺点，结合乳剂凝胶的优点，制备Sal B-TSN Ⅱ A -GA （STG）微乳凝胶，并通过微针给药，考察微针-微乳凝胶的促渗透效果，为临床纳米制剂给药及痤疮治疗提供一定依据。

1材料

1.1药物及主要试剂

TSN Ⅱ A （批号160428）、Sal B（批号MUST-12020104）、GA（批号171215），宝鸡国康生物制药有限公司；聚山梨酯80（Tween 80，天津市福晨化学试剂厂）；甲醇、甲酸（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

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1.2主要仪器

Waters高效液相色谱仪（美国）；双显恒温加热磁力搅拌器SH-3（北京金北德工贸有限公司）；Beckman X-22R型高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）；TK-24BL型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；滚轮微针（540针，针长500、750、1 000 μm，传奇美美容仪器厂家）；JS10超细匀浆机（扬州均瑞机电设备制造有限公司）；Vortex genius 3IKA圆周振荡器（上海右一仪器有限公司）。

1.3实验动物

雄性SPF级昆明种小鼠，5周龄，体质量（20±5）g，购于广州中医药大学，实验动物生产许可证号SCXK（粤）2019-0047。所有与动物相关的程序均符合广州中医药大学伦理委员会批准的动物护理协议，动物实验伦理批准号为NO 44005900002837。

2方法与结果

2.1STG微乳凝胶的制备

2.1.1微乳的制备称取卵磷脂500 mg，连同TSN Ⅱ A 和GA，加入0.2 mL的中链脂肪酸和1 mL乙醇，超声至溶解，60 ℃恒温水浴，即得油相。将Sal B加入10 mL纯水溶解，60 ℃恒温水浴，即得水相。保温条件下，同温水相加入到油相中，使用高速均质分散器以10 000 r·min-1分散2 min制备初乳，超声细胞粉碎机中200 W探头超声5 min，即得乳剂。

2.1.2STG微乳凝胶的制备　取溶胀好的卡波姆凝胶与微乳混合充分搅拌至均匀，使得凝胶浓度为1%，含TSN II A 、Sal B、GA分别为0.18、1.05、1.53 mg·g-1。

2.2STG微乳凝胶的处方优化

2.2.1STG微乳凝胶成形评分标准参照文献报道 ［ 15］，对制备的STG微乳凝胶进行评价，以STG微乳凝胶的光泽性、涂展性、均匀度、离心性的综合评分为考察指标，筛选其制备的最佳工艺，具体评分标准见表1。

2.2.2Box-Behnken响应面法实验设计本实验根据前期预试验及相关文献报道 ［ 16］，利用BBC设计原理，选取卡波姆用量（A）、微乳用量（B）、pH值（C）作为考察因素，以综合评分为响应值，设计3因素3水平的响应面优化实验，具体因素表见表2。

Box-Behnken响应面法优选制备工艺实验设计及其结果见表3，方差分析见表4。采用Design-Expert进行数据分析，以因变量Y对3个自变量进行模型拟合，并通过相关系数（R 2 ）对拟合模型进行评价，通过比较各拟合方程的拟合度，得到二次多项式回归方程Y＝91.40－9.00 A＋6.2 B＋1.25 C＋7.00 AB－2.50 AC＋1.00 BC－10.95 A 2 －7.95 B 2 －19.95 C 2 ，R2＝0.942 1，P＜0.01，F＝12.66，表明模型差异性极显著；失拟项P＝0.080 1＞0.01，差异不显著，说明该模型实验误差小，拟合度和可信度均可靠，可以用此模型对乳剂凝胶的制备工艺进行分析和预测。

2.2.3响应面优化分析根据拟合方程，通过Design-Expert V 8.0.6.1软件绘制综合评分随各因素变化的等高线图和响应面图。

由图1可知，卡波姆用量、微乳用量、pH对综合评分的影响均为抛物线关系，即在一定范围内，综合评分随着3者含量的增加先增大后减小。分析各图可知，卡波姆用量曲面最陡，微乳用量次之，pH最不显著，说明卡波姆用量对综合评分影响最为显著，pH影响不显著；由等高线图可知，AB交互作用最为明显，对综合评分影响最为显著。

2.2.4制备工艺优化结果及验证分析回归模型，根据优化的处方剂量，结合实际情况，各因素值保留为整数，即卡波姆用量1.00%、微乳用量0.10 g、pH 6。在此条件下进行3次平行实验，综合评分平均值为94.21与理论值93.73比较接近，且RSD＜4%。说明该回归方程与实际情况拟合较好，该最佳工艺切实可行，可操作性强。

2.3体外透皮考察

2.3.1皮肤预处理30 只雄性昆明小鼠适应性饲养3 d，取体质量合格的健康小鼠24只，脱颈椎处死，采用剃毛器配合脱毛膏脱去小鼠腹部被毛，剥去腹部皮肤，剔除脂肪、肌肉层及结缔组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干，铺平，-20 ℃冰箱保存，制备离体鼠皮备用。

随机分成STG微乳凝胶组（A）和500 μm（B）、700 μm（C）、1 000 μm（D）3种不同微针长度的“STG微乳凝胶＋微针”组，每组平行6份。A组涂抹载药微乳凝胶；B、C、D 3组分别用滚轮微针沿4个交叉方向滚动处理离体鼠皮（滚动方向如图2所示），每个方向滚动5次 ［ 17］，涂抹STG微乳凝胶。采用TK-12D型透皮扩散试验仪，进行体外透皮实验。将离体鼠皮真皮层向下，固定在供给池和接收池之间，透皮面积为3.14 cm 2 ，接收池体积为20 mL，分别将空白微乳凝胶和载药微乳凝胶（1 g）涂抹于鼠皮角质层上，接收室中注入接收液35%甲醇，排除气泡，在液面处画1条线作为标记。水浴温度（37.0±0.5）℃，磁力搅拌速度为200 r·min-1（模拟人体皮肤上的血液内循环），分别于2、4、6、8、10、12、24 h取接收液2 mL（及时补充同温接收液至标记处），取得试样经0.22 μm微孔滤膜滤过，用高效液相法测定含量 ［ 18］。按以下公式计算各时间点的单位面积累积透皮量（Q n ）。

C n 为第n次取样测定浓度，V为扩散池体积，Vi为每次取样体积（mL）；C n 和C i 分别为第n次和第i次取样时接收液的浓度；A为有效皮肤渗透面积（cm 2 ）

2.3.2体外渗透曲线以t为横坐标，Q n 为纵坐标，绘制TSN Ⅱ A 、Sal B、GA 3种组分的体外渗透曲线，见图3。

2.3.3体外透皮参数采用Higuchi函数方程对数据进行模型拟合，得到各组药物的透皮速率（Js），并计算皮肤滞留量（Q0），结果见表5。

2.3.4Q0实验结束后取下皮肤，剪掉未接触药物的边缘皮肤，用生理盐水冲洗，再用棉签蘸取生理盐水由中央向周围擦拭净皮肤表面残留药物3次，用干棉签将皮肤表面擦干。将鼠皮剪碎，加入接收液0.5 mL匀浆，再加入接收液1.0 mL混匀，超声提取20 min，涡旋振荡3 min，10 000 r·min-1离心10 min。取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液测定含量 ［ 18］，由相应的标准曲线计算药物浓度，再计算Q0。

由图3和表5可知，与TSN Ⅱ A 比较，Sal B和GA的透皮吸收较好，这可能与药物的亲水性与亲脂性有关。比较STG微乳凝胶经过与不同长度微针配合使用后的透皮情况，Q n ：D＞C＞B＞A，即1 000 μm组＞700 μm组＞500 μm组＞微乳凝胶组。说明经过微针处理药物的透过量增多，且在一定范围内，微针长度越长，透过效果越好，本实验以1 000 μm微针处理透皮效果最佳。除此之外，Sal B和GA在不同处理条件下的Js均为D＞C＞B＞A且均较低，显示了一定的缓释作用；3种药物的Q0相对较高，原因可能是制剂进入皮肤后，形成了药物储存，随后再与皮肤发生相互作用，药物在皮肤中的储存量大可以延缓药效的发挥，可增强缓释作用。结合Higuchi函数方程模型拟合结果，表明几种药物在不同微针处理下的渗透动力学均符合Higuchi函数方程，显示了良好的透皮特性和缓释效果。

2.4炎症药效

2.4.1分组与给药取30只雄性昆明小鼠，随机分成5组，除空白凝胶组，其他4组同“2.3.1”项的分组，每组6只，实验前用乙醚将小鼠麻醉，用宠物电推剪剃净小鼠背部皮肤约2 cm×2 cm大小区域的毛发，75%医用酒精消毒以备给药。空白凝胶组与STG微乳凝胶组（A组）小鼠背部皮肤不用微针处理，直接涂抹空白凝胶和STG微乳凝胶，使用微针的B、C、D 3组小鼠背部皮肤分别用不同长度微针处理后，涂抹STG微乳凝胶，给药剂量每只1 g，每日2次 ［ 19］。

2.4.2足肿胀实验 ［ 20］各组于第3天给药1 h后，在右踝关节处画圈标记，用溢水法 ［ 21］测定各组鼠右后足的容积，作为小鼠右后足的正常容积。之后各组在右后肢足掌心向关节方向进针，sc 10%鸡蛋清（每只0.1 mL）致炎。分别于致炎后1、2、4、6 h测定右后足的容积。分别计算各组小鼠的足肿胀度，比较各组肿胀度的差异。

足肿胀度＝（致炎后足容积－致炎前足容积）/致炎前足容积

2.4.3微乳凝胶微针透皮给药小鼠足趾肿胀抗炎效果如表6所示，与空白凝胶组比较，A组小鼠足肿胀度有所降低，但无显著性差异，说明STG微乳凝胶具有一定的抗炎作用，但效果不佳；C组在致炎后1、2、4 h足肿胀度显著降低（P＜0.05、0.01）；D组在各个时间点足肿胀度均显著降低（（P＜0.05、0.01）。与A组比较，B、C、D组小鼠足肿胀度均明显减轻，其中以D组小鼠足肿胀度减轻最为显著，且在各个时间点均具有显著性差异（P＜0.05、0.01），说明不同微针处理后给药，STG微乳凝胶能显著抑制10%蛋清引起的炎症反应，以微针长度为1 000 μm时透皮促渗效果最好、STG微乳凝胶抗炎作用最明显。

2.5STG微乳凝胶对小鼠皮脂腺斑组织的作用

2.5.1实验动物分组及给药30 只雄性昆明小鼠随机分成5组，分组及给药方法同“2.4.1”项，连续给药7 d。

2.5.2测定方法给药7 d后，小鼠脱颈椎处死，剔除小鼠腹部的被毛，摘取下侧腹部皮脂腺斑组织放入8～10倍体积的中性福尔马林组织固定液中，切片后HE染色，并在显微镜下观测其组织结构。

已有文献报道，生理情况下小鼠皮脂腺排列疏松且部分开口于毛囊，结构完整；病理情况下皮脂腺体积相应变大且数量增多 ［ 22］。基于此，本研究根据各给药组皮脂腺变化情况（图4）判断可知：与空白凝胶组比较，各组小鼠皮脂腺数目减少且体积变小，其中以1 000 μm组皮脂腺体积最小、腺体萎缩程度最重且排列最疏松、700 μm组次之。由此可知，STG微乳凝胶结合微针给药可使皮脂腺发生萎缩，在一定程度上控制皮脂分泌，且以微针长度1 000 μm组的效果最佳。

3讨论

痤疮是发生在毛囊皮脂腺的一种慢性炎症性皮肤病，好发于青春期 ［ 23］。目前，本病临床治疗主要以口服和外用抗生素或异维A酸类药物为主，但两者临床应用均具有一定局限性，抗生素易耐药、异维A酸存在副作用 ［ 24］。而本实验考察的微乳凝胶剂属于透明半固体制剂，和传统制剂比较，易于涂抹和吸收，且能长时间与皮肤黏附，生物相容性良好，不经过胃肠及肝脏代谢，副作用小，疗效可靠，患者顺应性好。与此同时，采用滚轮微针给药，提高了药物透皮率，促进了药物的吸收，更加适于作为痤疮给药的制剂形式。

3.1药效成分的选择

丹参各脂溶性成分中TSN Ⅱ A 含量相对较高，约为药材的0.1%～0.9%。水溶性成分中Sal B的含量较高，约占总丹酚酸的70%，且在水溶性成分中活性最强。TSN Ⅱ A 和Sal B为丹参中发挥抗炎、抗凝血、抗纤维化等药理作用的主要活性成分 ［ 25-27］。三萜皂苷是甘草中最主要的活性部位，甘草酸为其代表。但甘草酸的口服生物利用度较低，主要经肠道水解直接或分步脱去葡萄糖醛酸生成GA后被吸收。GA进入血液后，羟化代谢生成相应的代谢产物发挥抗炎杀菌等药效作用。同时，GA具有两亲性物质的结构特点，能与细胞膜上胆固醇或磷脂相互作用，辅助药物跨膜运输 ［ 28-29］。

故选择Sal B、TSN Ⅱ A 、GA 3个成分制备抗炎微乳凝胶，协同增效。

3.2微乳的形成

微乳的形成通常包括油相、水相、乳化剂3种，在其制备微乳的过程中，乳化剂的种类、乳化温度、pH是影响成型的关键因素。本实验所制备微乳为水包油（O/W）型，通常选用亲水疏水平衡（HLB）值为8～18、毒性较小的非离子型乳化剂。实验结果表明，当选用聚山梨酯80时，水油两相能够迅速被乳化，形成微乳；当乳化温度为60 ℃时，乳剂澄清透明。实验发现，乳化温度高于或低于60 ℃，微乳的外观状态均较差，当高于60 ℃时微乳的物理外观由澄清透明逐渐变浑浊，当低于60 ℃时，乳化能力不够。pH值对微乳形成的影响主要与分子结构有关，本实验中Sal B中含有较多酚羟基，能够与水分子形成氢键，这种分子键氢键阻碍了水分子与表面活性剂分子之间的作用力，从而对微乳的形成产生影响，载药微乳中含Sal B越多，其与水相之间的作用力越强，对微乳的形成影响越大。相关文献报道显示 ［ 8］，Sal B在pH 3.32的缓冲盐溶液中，稳定性最佳，故本实验选用甘氨酸与0.1 mol·L-1盐酸配制的缓冲盐溶液作为水相。

药物透皮吸收过程包括释放、穿透及吸收。虽然基质与皮肤的水合作用，能增加药物的穿透，油包水（W/O）型乳剂基质较O/W型乳剂基质水合作用强，但本实验中TSN Ⅱ A 极不稳定，制备成O/W型乳剂可以保护TSN Ⅱ A ，提高稳定性。除此之外，影响药物吸收的还有药物的性质和相对分子质量，一般脂溶性药物与皮肤性质相似更易穿透皮肤，但由于组织液的极性，导致药物又必须具有一定的极性，因此，具有一定油溶性和水溶性的药物穿透作用较理想。而在油、水中都难溶的药物则很难透皮吸收，强亲油性药物可能聚积在角质层表面而难以透皮吸收。当药物穿透表皮后，相对分子质量又成为影响吸收的主要因素，通常相对分子质量愈小，吸收愈快，反之亦然。而本研究选用的3种药物既包括亲脂性，又包括亲水性，通过乳剂作为载体，正好符合药物促透的机制，选用卡波姆作为基质，制备成微乳凝胶，延长了与皮肤接触的时间，正好满足透皮给药的条件，有利于药物的进一步释放，从而发挥药效。

3.3微针的使用

人体皮肤角质层厚15～20 μm，为皮肤的主要屏障。使用滚轮微针滚动时，可短暂破坏角质层，形成多个微小孔道，再进行微乳凝胶的涂抹，可物理促透药物。微针联合给药与单独使用透皮制剂比较，可显著提高药物透皮吸收的效率，促进水溶性药物的透皮吸收和提高大分子药物的透皮能力。

微针的长度是引起疼痛的主要因素，微针头的形状、厚度、宽度等并不会影响疼痛感。一般人体皮肤1 mm下才有丰富的神经和血管，故微针刺入皮肤深度达1 mm以上时，疼痛才会明显增加。而且即使微针刺入深度达到1.5 mm，产生的疼痛感也比普通皮下注射小的多。一般认为微针在角质层形成的通道会在15 min后关闭，发生感染及出血的可能极低，大量的临床和动物实验也没有相关微针引起感染的报道 ［ 30-32］。

本实验使用1 000 μm滚轮微针滚动时，操作简易，刺入皮肤深度未完全达到1 000 μm，人体尝试没有明显痛感。同时在动物实验和实验者的试验中未发现该微针对皮肤造成红斑、水肿等皮肤功能紊乱的实际伤害，使用较为安全。

3.4接收液的选择

本实验所选模型药TSN Ⅱ A 、GA均为脂溶性物质，在水中溶解度差，而在甲醇中溶解度较好，结合3者的溶解性能，最终选用在接收液中增加甲醇以提高药物溶解度。但高浓度的甲醇可破坏小鼠皮肤的生理结构，综合考虑，最终选用30%的甲醇作为接收液进行体外透皮实验。另或可选用加入一定剂量的乳化剂如聚山梨酯80的水溶液作为接收液，以增加药物的溶解度，但此法需要实验进一步验证。

体外透皮和小鼠足肿胀实验说明，不同微针均能提高药物的透过率与减轻小鼠足肿胀。与微乳凝胶组比较，不同长度微针处理后，TSN Ⅱ A 、Sal B和GA 3种药物的透过率均有所增强，且透过量与微针长度成正相关，随着微针长度的增长，Q n 也增多，这与微针处理时刺透了皮肤的角质层有关，微针刺透皮肤角质层会形成细小的通道加速药物的透过，微针长度越长，细小孔道越长，药物透过更易到达真皮层，因此透过量越高。同理，透过的药物量越高，发挥抗炎作用的药效成分越多，即小鼠足肿胀减轻程度越明显。

本研究以微乳作为药物载体，以微针-微乳凝胶作为给药方式，既增大脂溶性药物在水中的溶解度和皮肤给药的促透作用，提高药物的生物利用度，又实现了中药丹参与甘草的联合使用，增强了药物的治疗作用，为今后研制中药复方微乳和给药形式提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：曹凤媚，胡等慧． 丹酚酸B-丹参酮ⅡA-甘草次酸微乳凝胶微针透皮给药的评价 [J]. 药物评价研究, 2022, 45(10): 2039-2048.